Stanovení respirace gazometricky

Proces respirace v rostlinách vytváří energii ve formě ATP pro řadu důležitých procesů zejména v orgánech, kde neprobíhá fotosyntéza. ATP vyprodukovaný při respiraci spotřebovávají tři hlavní pochody v rostlině - růst (tvorba nové biomasy), obnova a udržování stávající biomasy a aktivní příjem minerálních živin (zejména dusíku). Rychlost respirace tedy především závisí na rychlosti, s jakou zmíněné procesy v rostlině energii spotřebovávají. Vysoké rychlosti respirace můžeme zaznamenat hlavně u mladých vyvíjejících se rostlin nebo rostlinných orgánů.
Faktory vnějšího prostředí, jako například nedostatek minerálních živin, mohou rychlost respirace výrazně ovlivnit, a to hned několika mechanismy. Nedostatek minerálních živin především výrazně zpomaluje růst nové biomasy. Dále se může měnit energetická náročnost příjmu živin a také složení nové biomasy, kterou je potřeba udržovat. Odlišný mechanismus působení na procesy respirace může mít z minerálních živin fosfor, který se přímo podílí na konzervaci energie v ATP. Nedostatek fosfátových iontů jako substrátu pro fosforylační reakce může přímo působit zpomalení rychlosti respirace. Mezi další důležité vnější faktory patří teplota. Za nízkých teplot (pod 10°C) je rychlost respirace rostlin obvykle nízká, při vysokých teplotách (nad 40°C) je vysoká. Krátkodobé teplotní výkyvy však mohou kdykoliv, podobně jako jiné pro rostlinu stresující faktory (např. přítomnost toxických látek, útok patogena apod.), vyvolat dočasné zvýšení rychlosti respirace. 

Příprava aparatury k měření a stanovení referenční koncentrace CO2 :

  1. Sestavíme měřící aparaturu podle uvedeného schématu. Zejména dobře zkontrolujeme napojení přívodu vzduchu na analyzátor, aby vzduch protékal správným směrem a spoje těsnily.
  2. Do systému zapojíme prázdnou měřící nádobku, vložíme ji do vodní lázně, jejíž teplotu průběžně kontrolujeme teploměrem, a spustíme průtok vzduchu.
  3. Zkorigujeme rychlost průtoku vzduchu přes měřící nádobku na hodnotu 0.2 až 0.3 l·min-1 a necháme systém cca 5-10 minut ustalovat.
  4. Po ustálení signálu na analyzátoru odečteme hodnotu referenční koncentrace CO2 v procházejícím vzduchu, s níž se budou koncentrace CO2, naměřené u pokusných vzorků, porovnávat.
  5. Měření referenční hodnoty koncentrace CO2 v procházejícím vzduchu je vhodné zopakovat také v průběhu, nebo alespoň po skončení experimentu pro ověření stability analyzátoru a homogenity zdroje vzduchu.

Schéma zapojení aparatury pro měření rychlosti respirace gazometricky - infračerveným analyzátorem plynů (IRGA):

Úloha 1: Stanovení vlivu nedostatku minerálních živin na rychlost respirace

Budeme měřit a srovnávat rychlost respirace kořenů rostlin vypěstovaných v kultivačním experimentu za nedostatku vybraných živin s kontrolními rostlinami.

  1. Odřízneme kořenový systém od 1 až 4 rostlin, kořeny opatrně osušíme a vložíme do měřící nádobky, kterou těsně uzavřeme zátkou.
  2. Nádobku se vzorkem připojíme pomocí trubiček do měřícího systému, vložíme do lázně termostatu a podle potřeby zkorigujeme rychlost průtoku vzduchu přes měřící nádobku na hodnotu 0.2 až 0.3 l·min-1. V průběhu následujících 5-10 minut dojde v nádobce k ustálení teploty i rychlosti výdeje CO2 vzorkem.
  3. Po době ustalování sledujeme hodnoty na analyzátoru v minutových intervalech. Pokud se zobrazená hodnota ve třech po sobě následujících intervalech už nemění, zapíšeme ji do tabulky výsledků a následně použijeme pro výpočet rychlosti respirace vzorku.
  4. Společně s hodnotou koncentrace CO2 zapíšeme také aktuální rychlost průtoku v systému a zkontrolujeme také aktuální teplotu vodní lázně.
  5. Odpojíme měřící nádobku ze systému, vzorek kořenů pečlivě beze zbytku vyndáme a stanovíme jeho sušinu.
  6. Měření provádíme v jednom až třech opakováních u každé varianty.
  7. Rychlost respirace jednotlivých vzorků vypočítáme podle vztahu:

    Vr = (Δ CO2 * f * k)/ m         (µmol·g-1·h-1)

    Δ CO2 - rozdíl naměřené a referenční koncentrace CO2 po průchodu nádobkou (ppm, tj. µl·l-1)
    f - rychlost průtoku vzduchu systémem při měření (l·h-1)
    k - převodní koeficient pro převod objemového množství CO2 (µl) na látkové množství (µmol); pro teplotu 22 °C a průměrný atmosférický tlak je
    k = 0,041 (µmol·µl-1). (Pro přesné stanovení je možné vypočíst ze stavové rovnice plynů [p*V=n*R*T] podle aktuální teploty a tlaku v den měření.)
    m - hmotnost sušiny vzorku (g)

Úkoly: 


Úloha 2 : Sledování změn v rychlosti respirace u semen v různém stádiu klíčení

Budeme sledovat rychlost respirace u semen, která byla nabobtnána ve vodě před dvěma dny, a porovnávat je se semeny, která bobtnala pouze několik hodin.

  1. Měřící aparaturu připravíme k práci stejným způsobem jako v úloze 1.
  2. Do měřící nádobky dáme vzorek (20-30 semen) a postupujeme stejně jak bylo popsáno v předchozí úloze. U některých vzorků bude pravděpodobně nutná úprava rychlosti průtoku vzduchu. 
  3. Po skončení měření stanovíme sušinu vzorku a všechny naměřené hodnoty zapíšeme do tabulky. 

Úkoly:


Úloha 3 : Stanovení vlivu teploty prostředí na rychlost respirace

Budeme sledovat rychlost respirace kořenů rostlin za různých teplot.

  1. Měřící aparaturu připravíme k práci stejným způsobem jako v úloze 1.
  2. Do měřící nádobky dáme vzorek kořenů pokusných rostlin a postupujeme stejně jako v úloze 1.
  3. Teplotu vodní lázně, do níž se vkládá měřící nádobka, nastavíme postupně na nízkou (např. 10°C), optimální (20-25°C) a vysokou (30-40°C) teplotu.
  4. Po dosažení požadované teploty vodní lázně necháme systém ustálit a po ustálení odečteme hodnotu koncentrace CO2 a rychlost průtoku procházejícího vzduchu.
  5. Po skončení měření stanovíme sušinu vzorku a všechny naměřené hodnoty zapíšeme do tabulky. 

Úkoly: