Kultivační experiment - vyhodnocení

1. Analýza růstu rostlin - teorie

Růst rostlin lze definovat jako přírůstky hmotnosti rostlin v čase. Jde o veličinu, v níž se integrujícím způsobem odráží všechny metabolické procesy  probíhající v rostlině a která tak poměrně přesně indikuje metabolický stav rostliny. Přitom jde o veličinu, která je poměrně jednoduše gravimetricky kvantifikovatelná. Například, pokud je rostlina pěstována za nízkých teplot, projeví se tento stav pravděpodobně menší rychlostí růstu oproti rostlinám pěstovaným za optimálních teplot. Zjišťovat vliv nízké kultivační teploty na jednotlivé metabolické procesy v rostlině by bylo metodicky velmi náročné (museli bychom kvantifikovat např. rychlosti respirace, fotosyntézy, příjmu živin, transpirace...) a rovněž velmi pracné. Snížení růstu vlivem nízkých teplot naopak můžeme kvantifikovat poměrně snadno.

Hmotnost rostlin vyjadřujeme dvěma veličinami. Čerstvá hmotnost (neboli hmotnost svěží hmoty, zkratky FW - fresh weight nebo lépe FM - fresh mass) je hmotnost rostlinných pletiv v intaktním stavu, tedy i s obsaženou vodou. Jak již víte z cvičení na téma Transpirace, obsah vody v pletivech rostlin je však značně proměnlivý. Z tohoto důvodu se čerstvá hmotnost (FM) používá v případě, že stanovujeme nějaký rostlinný metabolit, který by při vysoušení vzorku v sušárně byl nezvratně poškozen - např. fotoasimilační pigmenty, proteiny, DNA apod. Pro analýzu růstu rostlin a např. obsahu jednotlivých minerálních živin v pletivech rostlin je lépe použít tzv. suchou hmotnost (neboli sušinu, zkratky DW - dry weight nebo lépe DM - dry mass). Tu připravíme vysušením pletiv v sušárně při teplotě 80 °C do konstantní hmotnosti. V rámci vyhodnocení kultivačního experimentu budete pracovat výhradně se sušinami jednotlivých orgánů rostlin.

Z dalších znaků charakterizujících růst budete stanovovat velikost listové plochy (LA). V rámci cvičení k tomuto účelu využijete speciální aparaturu založenou na stolním skeneru a speciálním programu, provádějícím některé operace z takzvané analýzy obrazu (zejména takzvané prahování - thresholding). S obsluhou tohoto zařízení vás seznámí cvičící přímo v rámci cvičení. Alternativní metodou je nepřímé gravimetrické stanovení listové plochy, které můžete použít ve své praxi v případě, že nebudete mít dostupný daný systém analýzy obrazu. Jeho principem je obkreslení obrysů listů na A4 list xerografického papíru, vystřižení těchto "listů" a jejich zvážení. Listovou plochu snadno zjistíte přepočtem přes hmotnost celého listu A4, tedy trojčlenkou.

Pro stanovení délky kořenů (RL) využijete metodu počítání průsečíků se čtvercovou mřížkou (GLI, grid-line intersect method). Principem metody je náhodné rozmístění kořenů na list papíru s vytištěnou čtvercovou mřížkou a spočtení všech míst, kde kořeny tuto čtvercovou mřížku protínají. Je vhodné počítat průsečíky nejprve s linkami jedné orientace (např. vertikálními) a teprve poté s linkami k nim kolmými (tedy horizontálními) a poznamenat si mezisoučty. Pro případ, že se daný kořen čtvercové mřížky pouze dotýká, ale neprotíná jej, je nutné stanovit si tzv. počítací rámec: kořeny, které se dotýkají v daném elementárním čtverci jeho pravé nebo spodní hrany do počtu průsečíků nepočítáme (viz fialové x na obrázku), zatímco kořeny dotýkající se levé nebo horní hrany elementárního čtverce započítáváme. Odhad délky kořenů zjistíme výpočtem jako: RL=N×(a/1,25) kde N...celkový počet průsečíků a...délka hrany elementárního čtverce v mřížce Celkovou délku kořenového systému můžeme stanovit po částech, což je výhodné u velkých vzorků. Metoda GLI má široké uplatnění, používá se např. i její mikroskopická varianta (čtvercová mřížka na sklíčku vkládaném do okuláru). Metoda GLI předpokládá, že jednotlivé objekty jsou na mřížce směrově neuspořádané, tedy nahodile orientované. V případě paralelního vyskládání objektů (kořenů) na mřížku se můžete dopustit až 25% chyby odhadu délky kořenů!

V rámci cvičení budete rovněž stanovovat některé odvozené znaky, používané v metodě nazývané růstová analýza. Jejich přehled, včetně výpočetních vzorců, udává následující tabulka: 

2. Vlastní vyhodnocení kultivačního  experimentu:

A. Vizuální pozorování rostlin:
Jako součást protokolu uvedete výsledky vizuálního pozorování rostlin. Všimnete si zejména výšky rostlin, obsahu fotoasimilačních pigmentů a růstu kořenového systému.

B. Destruktivní analýza rostlin
Jednotlivou rostlinu opatrně vyjmete z kultivační nádobky a IHNED si na papírový sáček poznamenáte, jakou experimentální variantu tato rostlina reprezentuje. Na sáček rovněž ihned poznamenáte vaše jméno a seminární skupinu. Nejprve stanovíte listovou plochu: listy ostříháte v oušcích, naskládáte je do průsvitné PE složky tak, aby se nepřekrývaly a nebyly pokroucené a analyzujete pomocí skeneru a PC programu. Hodnotu listové plochy poznamenáte na sáček (v cm², zaokrouhlíte na jedno desetinné místo), listy zabalíte do svazečku a vložíte do sáčku. Poté stanovíte kořenovou délku. V případě déletrvajícího stanovení je třeba kořeny průběžně zvlhčovat. Je nutné dbát, aby byly na mřížce rozprostřeny všechny kořeny, včetně jemných laterálních kořenů. Hodnotu délky kořenů opět poznačíte na papírový sáček (v cm), kořeny zabalíte jako svazek do filtračního papíru a spolu se stéblem je vložíte do sáčku. Obilku do sáčku nevkládejte, neanalyzuje se! Sáček, v němž jsou kořeny, listy a stéblo a který má na sobě údaje o experimentální variantě, vašem jménu, seminární skupině, listové ploše a kořenové délce uzavřete a odevzdáte vyučujícímu na stanovené místo, který jej na konci cvičení umístí do sušárny.

3. Výměna živných roztoků

V rámci cvičení vyměníte živné roztoky ve všech vanách, v nichž jsou pěstovány rostliny pro 2. odběr. Iniciální hodnotu pH nastavíte pomocí roztoku NaOH na 5,5. Po týdenní kultivaci pak zaznamenáte změny pH v každé jednotlivé variantě.

4. Úkol ke cvičení